Сравнительная характеристика чумы и туляремии

Дифференциально-диагностические критерии чумы и туляремии

как правило, отсутствует

может быть на месте входных ворот

наличие специфических туляремийных гранулем

паховые, подмышечные, шейные лимфоузлы;

один или несколько;

подмышечные, паховые, бедренные лимфоузлы;

n спаянность с окружающими тканями

n кожа над бубоном

спаян с окружающей клетчаткой;

напряжена, красная, рисунок сглажен;

нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево

лейкопения (в первые дни болезни может быть лейкоцитоз) со сдвигом влево, лимфоцитоз, моноцитоз

Изменения со стороны сердечно-сосудистой системы:

прогрессивно нарастающая тахикардия;

геморрагические высыпания, буллезные образования, вторичные гематогенные пустулы и карбункулы

экзантема эритематозного, макулопапулезного, розеолезного, петехиального характера

Токсическое поражение ЦНС в виде оглушенности, возбуждения, бреда, галлюцинаций

Методические указания к практическим занятиям по теме: «Чума. Туляремия»

Страницы работы

Содержание работы

Методические указания

к практическим занятиям для студентов лечебного и педиатрического факультетов НГМА по теме «Чума. Туляремия.»

Актуальность темы. Чума и туляремия относятся к заболеваниям с природной очаговостью. Оба заболевания протекают остро с интоксикацией, поражением лимфатических узлов. Чума относится к группе карантинных инфекций.

Научиться выявлять симптомы различных форм чумы и туляремии, понять принципы диагностики данных нозологий, определять возможные осложнения, проводить дифференциальную диагностику, осуществлять лечение и профилактические мероприятия.

Исходный уровень знаний и умений. Студенты должны знать:

а) Характеристику возбудителей чумы и туляремии б) Эпидемиологическую характеристику заболеваний в) Основные клинические проявления г) Основы специфической лабораторной диагностики чумы и туляремии д) Подходы к лечению данных заболеваний

Новая информация и практические навыки, которые необходимо усвоить при самоподготовке и на занятиях:

1-й уровень – знать:

этиологию, эпидемиологию заболеваний, клиническую классификацию чумы и туляремии, основные клинические проявления.

2-й уровень – понимать:

а) патогенез происходящих изменений в организме больных чумой и туляремией, в) диагностическую значимость различных методов лабораторной диагностики чумы и туляремии, г) обоснованность лечебных мероприятий, д) смысл профилактических и противоэпидемических мероприятий.

3-й уровень – уметь:

а) выявлять жалобы больного, анамнез заболевания, эпид. анамнез, анамнез жизни, б) оценить объективный статус больного, в) обосновать предварительный диагноз, г) составить план обследования и лечения больного, д) провести дифференциальную диагностику с заболеваниями, имеющими сходную симптоматику.

Задания для самоподготовки:

Контрольные вопросы к занятию.

1.Краткая характеристика возбудителя чумы. Источник инфекции, пути передачи.

2.Периоды в развитии эпидемии чумы, причины ее быстрого распространения.

3. Фазы патогенеза при чуме.

4. Классификация клинических форм чумы, их характеристика.

5.Заболевания, с которыми необходимо проводить дифференциальную диагностику легочной формы чумы.

6. Краткая характеристика возбудителя туляремии.

7. Понятие о природной очаговости болезни, источники и пути передачи инфекции.

8. Фазы патогенеза при туляремии.

9. Классификация клинических форм туляремии, их характеристика.

10. Характерные признаки туляремийного бубона, динамика его развития.

11. Отличительные признаки чумного и туляремийного бубонов.

12. Вспомогательные методы диагностики чумы и туляремии.

13. Общепринятые меры терапевтической тактики.

Чума. Туляремия.

Учебно-целевая задача: используя схемы дифференциальной диагностики, провести дифференциальный диагноз чумы или туляремии; назначить адекватные лечебные мероприятия неотложной помощи и лечения на госпитальном этапе.

Задание для самостоятельного изучения.

Используя учебник, «Руководство по инфекционным болезням», лекционный материал и список рекомендуемой литературы для приобретения необходимых базисных знаний, усвойте к семинару следующие разделы:

— этиология, свойства возбудителей чумы и туляремии;

— патогенез чумы и туляремии, особенности патогенеза в зависимости от реализации путей передачи инфекций;

— клинические проявления чумы и туляремии;

— дифференциальный диагноз чумы и туляремии (в соответствии с клиническими формами);

— лабораторные методы в диагностике чумы и туляремии;

— неотложная помощь и лечение больных чумой и туляремией.

Проверьте свои знания путем ответов на следующие вопросы:

— в чем заключается общность чумы и туляремии;

— клинико-эпидемиологические особенности изучаемых болезней при аэрогенном пути заражения;

— профилактика чумы и туляремии в войсках.

Материалы для самоподготовки к семинару. С целью уяснения ориентировочной основы действий при обследовании больных чумой и туляремией проанализируйте предлагаемые схемы дифференциальной диагностики синдромосходных состояний.

Вопросы, выносимые на семинар:

1. Современное состояние проблемы чумы и туляремии (природные очаги, заболеваемость).

2. Основные свойства возбудителей чумы и туляремии.

3. Современные представления о патогенезе чумы и туляремии. Клинико-патогенетические особенности заболеваний при аэрозольном пути передачи инфекции.

4. Клиника и дифференциальная диагностика (кожная, бубонная, легочная, септическая, кишечная формы).

5. Лабораторные методы в диагностике чумы и туляремии.

6. Неотложная помощь на МПП и лечение чумы и туляремии на госпитальном этапе.

Схема дифференциальной диагностики кожной и кожно-бубонной форм чумы, туляремии и других синдромосходных заболеваний

Схема дифференциальной диагностики легочной формы чумы и других синдромосходных заболеваний

Клинические проявления и диагностика туляремии

В зависимости от способов внедрения и места локализации микроба в организме болезнь принимает различные формы клинического проявления.

Но при всех клинических формах туляремии — это прежде всего общий остро протекающий инфекционный процесс с преимущественной локализацией возбудителя в лимфатических узлах. Туляремия характеризуется следующими основными особенностями: коротким инкубационным периодом (в среднем от 2 до 6 дней), внезапным началом (озноб, жар, усиленное потоотделение, головные и мышечные боли, общая слабость) и быстрым развитием явлений общей интоксикации организма (нарушение функций вегетативной нервной системы, упадок сердечно-сосудистой деятельности, понижение артериального давления, учащение и лабильность пульса, общая слабость, бессонница). Период лихорадочного состояния продолжается от 1 до 2—3 нед и характеризуется температурными ремиссиями с постепенным снижением температурной кривой к концу болезни. Период выздоровления затягивается до 20—30 дней в связи с медленным восстановлением нарушенных функций вегетативной нервной системы, сердечно-сосудистой деятельности, общего физического состояния и работоспособности больного.

Возбудитель туляремии в зависимости от места внедрения в организм локализуется в тех или иных органах и тканях, с чем связаны некоторые различия в клиническом проявлении болезни.

Министерством здравоохранения СССР рекомендована следующая классификация клинических форм туляремии.

I. По локализации процесса: А. Формы туляремии с наружно выраженными поражениями кожи, слизистой оболочки и лимфатических узлов: 1) бубонная, 2) язвенно-бубонная, 3) глазная, 4) ангинозно-бубонная, 5) с другими наружно выраженными локализациями. Б. Формы туляремии с преимущественным поражением внутренних органов: 1) дыхательных путей, 2) желудочно-кишечного тракта, 3) других внутренних органов.

II. По длительности течения: 1) острая, 2) затяжная, 3) рецидивирующая.

III. По тяжести процесса: 1) легкая, 2) средней тяжести, 3) тяжелая.

Бубонная форма туляремии возникает при внедрении возбудителя через кожу с последующей локализацией в регионарных лимфатических узлах, расположенных у входных ворот. Развивающийся при этом воспалительный процесс в лимфатических узлах ведет к образованию бубонов. Туляремийные бубоны в отличие от чумных имеют резко очерченные контуры, подвижны, неспаяны с кожей и подкожной клетчаткой (отсутствие периаденитов), менее болезненны. В дальнейшем бубоны или постепенно рассасываются, или нагнаиваются ш медленно заживают с образованием рубца.

Иногда при генерализации процесса в последние дни болезни могут возникать по ходу лимфатических сосудов бубоны вторичного происхождения, которые обычно рассасываются без на гноения.

Язвенно-бубонная форма отличается от бубонной только последовательным образованием на месте внедрения микроба папулы, затем везикулы, пустулы и небольшой (не более 1 см в диаметре) кратерообразной язвы, которая медленно заживает под корочкой. После отпадения корочки на коже остается бурая пигментация или, редко, небольшой рубец. Наиболее часто эта форма возникает при заражениях через укусы кровососущих переносчиков.

Глазная (точнее глазо-бубонная) форма возникает при внедрении возбудителя через слизистую оболочку глаз и характеризуется резко выраженным конъюнктивитом, часто с образованием множественных некротических язвочек, сильной отечностью век, воспалительными процессами в регионарных (околоушных, подчелюстных, переднешейных) лимфатических узлах. Инфекционный процесс в случае поражения обоих глаз протекает в тяжелой затяжной форме.

Ангинозно-бубонная форма возникает при внедрении возбудителя через миндалины. Клинические симптомы: значительная отечность миндалин при отсутствии сильных болевых ощущений, образование серовато-белого некротического налета, спаянного с клетчаткой, гиперемия зева, бубоны в области шейных и подчелюстных лимфатических узлов большего размера (иногда по размеру больше куриного яйца). Чаще поражается миндалина с одной стороны. При двустороннем поражении миндалин болезнь протекает в тяжелой форме.

При алиментарных и аспирационных заражениях возникают соответственно желудочно-кишечная (абдоминальная) и легочная (торакальная) формы туляремии с соответствующей локализацией возбудителей в мезентериальных и торакальных лимфатических узлах. Местные поражения кожи или видимых слизистых оболочек при этих формах туляремии отсутствуют. Легочная форма туляремии чаще протекает как трахеиты, бронхиты и редко осложняется пневмонией, при которой резко ухудшается течение заболевания. Патогенез туляремии с преимущественным поражением внутренних органов недостаточно изучен.

Летальные исходы при туляремии и СССР встречаются во много раз реже, чем, например, в США, где они достигают 5—7%, что объясняется более высокими патогенными свойствами возбудителей туляремии, которые циркулируют в природных очагах на территории западного полушария.

При постановке клинического диагноза туляремии необходимо исключить сходные с ней заболевания, такие, как чума, сибирская язва, дифтерия, ангина Винцента, крупозная пневмония, сыпной и брюшной тифы.

Смотрите так же:  Аргентинское танго из запах женщины

При туляремии в отличие от чумы отсутствуют резко выраженные явления общей интоксикации (затемнение сознания, бредовое состояние, падение артериального давления); туляремийные бубоны резко очерчены, не спаяны с прилегающими тканями и значительно менее болезненны при ощупывании.

Туляремийные язвы отличаются от чумных более легким течением и меньшей болезненностью, от сибирской язвы — отсутствием отека окружающих тканей и характерного черного струпа, меньшим размером и болезненностью. Ангинозно-бубонная форма туляремии отличается от дифтерии менее тяжелым общим состоянием и самочувствием больного, отсутствием резко выраженных болевых ощущений в горле; от ангины Винцента — более тяжелым течением, отсутствием неприятного запаха изо рта.

Значительно труднее дифференцировать легочную и абдоминальную формы туляремии от крупозной пневмонии, сыпного, брюшного, возвратного тифов и паратифов; точный диагноз должен основываться на лабораторных исследованиях, эпизоотологических и эпидемиологических обследованиях.

Простыми, доступными для широкого круга медицинских работников и вполне падежными методами лабораторной диагностики служат аллергическая кожная проба с тулярином и реакция агглютинации.

Аллергическую пробу ставят внутрикожным и накожным способами. Внутрикожно тулярин вводят в дозе 0,1 мл на ладонной стороне предплечья. У больных туляремией положительная реакция в виде инфильтрата и гиперемии появляется через 24—48 ч (иногда даже через 8—10 ч).

Для накожной пробы пользуются концентрированным тулярином, одну каплю которого наносят на обработанную спиртом кожу плеча; через нанесенную каплю делают две параллельные насечки оспопрививательным пером, плоской стороной которого тулярин втирают в скарифицированный участок кожи. Реакция считается положительной, если вокруг насечек через сутки появляются отечность и краснота.

Положительные реакции проявляются уже на 5—6-й день заболевания; у переболевших туляремией и у привитых они сохраняются многие годы.

Серологическая реакция агглютинации ставится обычным методом по типу реакции Видаля с концентрацией туляремийного антигена (диагностикума) до 1 млрд, убитых микробных тел в 1 см 3 в окончательном разведении. Диагностическим считается титр не ниже 1:100 с учетом его нарастания при повторных обследованиях.

Для ускоренной серологической диагностики применяется упрощенный метод постановки реакции. Толстую каплю крови на предметном стекле смешивают с равным объемом туляремийного антигена. При отсутствии антигена толстую каплю высушивают на стекле и направляют на исследование в лабораторию.

У больных туляремией положительные серологические реакции появляются на 11—15-й день болезни с нарастанием титра агглютининов (максимальный титр на 8-й неделе). После заболевания и у привитых положительные реакции сохраняются многие годы.

Возбудитель туляремии обладает чрезвычайно высокой заразительностью, поэтому бактериологические исследования на туляремию следует проводить только в лабораториях со специальным режимом при отделах особо опасных инфекций санитарно-эпидемиологических станций, противочумных станций и специализированных институтов.

Далеко не всегда удается выделить возбудителя из крови, содержимого бубонов, еоскобов со дня язвы или других материалов от больного человека. Поэтому для бактериологической диагностики пользуются методом постановки биопробы с последующей бактериоскопией мазков из внутренних органов павших или забитых лабораторных животных и посевами на специальные питательные среды.

Сравнительная характеристика бубонов при чуме и туляремии

Лабораторная диагностика туляремии

Лечение туляремии

1. Строгий постельный (при легком течении – полупостельный) режим.

2. Основной вариант стандартной диеты.

3. Этиотропная терапия.

4. Патогенетическая и симптоматическая терапия.

Этиотропная терапия туляремии

55. Туляремия. Клинические формы. Дифференциальная диагностика с чумой. Лечение и профилактика

Клиническая классификация. Различают следующие формы туляремии:

    бубонная язвенно-бубонная глазо-бубонная ангинозно-бубонная абдоминальная легочная генерализованная

Клиника. Инкубационный период составляет от нескольких часов до 7 дней. Заболевание, как правило, начи­нается остро. Для всех форм туляремии характерна следующая симптоматика:

    быстрое повышение температуры тела до 39—40°С, сопровождающееся ознобом, головной болью, болями в мышцах (лихорадка ремиттирующего или интермиттирующего характера, ее продол­жительность чаще 2—3 нед) пастозность и гиперемия лица, конъюнктив, слизистой оболочки рта и носоглотки, инъекция склер увеличение различных групп лимфатических узлов, в том числе мезентериальных сыпь в виде эритемы, розеол, петехий или папул, иногда на симметричных участках («но­ски», «чулки», «перчатки» и др.); сыпь держится 8—12 дней, после нее остаются шелушение и пигментация гепатолиенальный синдром в начальном периоде болезни лейкопения крови, затем лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг, моноцитоз

Помимо общих проявлений туляремии, развиваются пора­жения, присущие различным формам болезни.

Бубонная форма. Чаще бывают подмы­шечные, шейные и подчелюстные бубоны (увеличенный единичный узел). Лимфатический узел мало болезнен, имеет четкие контуры, постепенно увеличивается. При нагноении вскрытие обычно происходит через 2—4 нед, при этом выделяется густой сливкообразный гной, рубцевание медленное. Исходами бубона, помимо его вскрытия, могут быть склерозирование и рассасывание.

Язвенно-бубонная форма. На месте укуса насекомого появляется па­пула, за 6—8 дней превращающаяся в неглубокую язву. Язва за­живает медленно путем рубцевания. Формирование первичного бу­бона происходит аналогично таковому при бубонной форме. Часто наблюдается лимфангоит.

Глазо-бубонная форма встречается при внесении возбудителя в глаз загрязненными руками. Чаще наблюдается одностороннее поражение: резкая гиперемия конъюнктив, появление папул и язвочек на них, отек век, значительное увеличение переднешейных, околоушных или подчелюстных лимфатических узлов. Процесс длит­ся от нескольких недель до нескольких месяцев.

Ангинозно-бубонная форма встречается при алиментарном пути заражения. Наблюдаются ги­перплазия миндалин, серовато-белые налеты, чаще с одной стороны. Постепенно развивается некротический процесс, появляются глубо­кие, медленно заживающие язвы. Односторонний лимфа­денит появляется одновременно с ангиной.

При абдоминальной форме на первом плане находится поражение мезентериальных лимфатических узлов. Характерны сильные боли в животе, рвота, метеоризм, задержка стула, иногда диарея. Эти симптомы связаны с раздражением брюшины. Иногда пальпируются увеличенные брыжеечные лимфатические узлы.

Легочная форма. Наиболее специфическими ее проявлениями являются неправильного типа лихорадка с обильными потами, слизисто-гнойная мокрота, определяемые рентгенологически с 7-го дня болезни увеличенные прикорневые, паратрахеальные и медиастинальные лимфатические узлы.

Генерализованная форма характеризуется тяжелым тифоподобным или септическим течением при отсутствии первичного аффекта и регионарного лимфаденита.

Дифференциальная диагностика чумы и туляремии

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему: Экспериментально-иммунологическое обоснование выбора стратегии оценки поствакцинального иммунитета против чумы и туляремии

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментально-иммунологическое обоснование выбора стратегии оценки поствакцинального иммунитета против чумы и туляремии

На правах рукописи

Фирстова Виктория Валерьевна

Экспериментально-иммунологическое обоснование выбора стратегии оценки поствакциналыюго иммунитета против чумы и туляремии

14.03.09 — Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук ^ ^ ^15

Работа выполнена в ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Караулов A.B.

Пронин Александр Васильевич, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, зам. директора по научной работе.

Рубальский Олег Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОНВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, проректор по научной и инновационной работе.

Апарин Петр Геннадьевич, доктор медицинских наук, ФГБУ Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, заведующий лабораторией полисахаридных вакцин.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится « 2015 г. на заседании

диссертационного совета Д 208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 и на сайте http://www.gabrich.com. Автореферат разослан «» _2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Крупные вспышки и спорадические случаи туляремии и чумы, относящиеся к особо опасным возвращающимся инфекционным заболеваниям, периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе, и в России [Балахонов C.B., 2013; Мокриевич А.Н., 2013; Попов Н.В., 2014]. Сохранение эпизоотически активных природных очагов, вероятность применения Francisella tularensis и Yersinia pestis при биотеррористических актах, сложность постановки клинического диагноза обусловливают необходимость разработки новых средств вакцинопрофилактики. В тоже время серьёзным препятствием в создании новых вакцин является отсутствие объективных критериев для оценки эффективности и продолжительности иммунитета.

Разработка методов оценки поствакцинального клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета является актуальным направлением, решение которого особенно необходимо для осуществления индивидуального подхода к ревакцинации; выбора антигенов, активирующих клеточное звено иммунитета, при конструировании вакцин; для заключения о наличии напряженного иммунитета, особенно против аэрозольного заражения инфекциями.

В нашей стране и странах СНГ для профилактики чумы и туляремии используются живые вакцины. Живая чумная вакцина и туляремийная вакцина обеспечивают защиту на один год и пять лет, соответственно, и требуют периодической ревакцинации. В случае ревакцинации живой вакциной человека, имеющего специфический иммунитет к инфекции, вакцинопрофилактика будет не эффективной. Это связано с активацией клеток памяти и синтезом антител и активацией клеточных реакций, которые приведут к элиминации бактерий вакцинного штамма до формирования иммунитета.

О наличии противочумного или противотуляремийного иммунитета судят по наличию антител в крови к F1 антигену Y. pestis и липополисахариду

F. tularensis, соответственно. В то же время при формировании противочумного и противотуляремийного иммунитета большая роль отводится обоим звеньям иммунной системы: гуморальному и клеточному. После вакцинации и заболевания туляремией или чумой появляются специфические антитела, которые играют определенную роль в защите от повторного заражения, но, тем не менее, не всегда коррелируют с защитой организма от инфекции [Ehrenkranz N.J., 1955; Burke D.S., 1977; Tärnvik A., 1989; Parent M.A., 2005]. Поэтому для оценки напряженности противочумного/противотуляремийного иммунитета необходимо выявлять как специфические антитела, так и оценивать специфические клеточные реакции.

Смотрите так же:  Температура и насморк у грудного ребенка

Поиску методов, позволяющих выявить наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета, посвящено множество работ [Витязева С.М., 2013; Аронова Н.В., 2014; Karttunen R., 1985; Kim E.J., 2008; Salerno-Gon?aIves R., 2009]. В 70-е годы оценку напряженности Т-клеточного иммунитета против туляремии и чумы проводили, используя накожную или внутрикожную аллергическую пробу с тулярином или пестином, соответственно. Однако широкого распространения эти методы не нашли в связи с побочными реакциями, проявляющимися в ухудшении состояния вакцинированного/больного (как проявление общей реакции организма), а в некоторых случаях развитием некроза (как проявление местной реакции). В дальнейшем для выявления специфического клеточного иммунитета предлагались реакции in vitro: реакция лейкоцитолиза с тулярином для оценки клеточного противотуляремийного иммунитета и показатель повреждения нейтрофилов в тесте с пестином — для оценки клеточного противочумного иммунитета. С появлением современных методов исследований наличие клеточного протиовотуляремийного и противочумного иммунитета пытались оценивать на основании подсчета эффекторных клеток памяти CD45RA /+, CD62″ [Salerno-Goncalves R., 2009], по усилению пролиферативной активности лимфоцитов [Витязева С.М., 2013], усилению синтеза клетками ИФН-у [Waag D.M., 1995; El Sahly Н. М., 2009], ИЛ-2 и ФНО-у [Eneslätt К., 2012] в ответ на рестимуляцию

клеток in vitro антигенами туляремийного или чумного микроба. Тем не менее, вопрос о методах оценки клеточного протиовотуляремийного и противочумного иммунитета остается открытым.

Цель исследования — разработать алгоритм оценки напряженности поствакцинального иммунитета к чуме и туляремии в реакциях in vitro.

1. Проанализировать наличие корреляции между изменением экспрессии маркеров лимфоцитов, их пролиферативной активностью, цитокиновой активностью в реакциях in vitro под влиянием тулярина, кислото-нерастворимого комплекса, рекомбинантного белка 1696, ультразвукового дезинтеграта F. tularensis и напряженностью иммунитета к туляремии у мышей.

2. Выявить различия в ключевых показателях специфической активации лимфоцитов под влиянием тулярина и кислото-нерастворимого комплекса F. tularensis, коррелирующие с защитой мышей от заражения бактериями туляремии различной вирулентности.

3. Оценить длительность протективного иммунитета к туляремии и длительность проявления специфических клеточных реакций в ответ на реактивацию лимфоцитов антигенами F. tularensis у мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной.

4. Изучить влияние степени воспаления, индуцированного разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ на формирование клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета.

5. Предложить методы оценки иммунитета к туляремии у людей.

6. Изучить изменение функциональной активности лимфоцитов под влиянием Fl, V, Pia антигенов и ультразвукового дезинтеграта Y. pestis в реакциях in vitro и выявить маркеры, отражающие наличие клеточного противочумного иммунитета.

7. Выявить различия в механизмах активации В и Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis и Y. pestis в клеточных реакциях in vitro у вакцинированных и невакцинированных против туляремии и чумы.

8. Предложить методы оценки иммунитета к чуме у людей.

9. Оценить иммунный статус у постоянно вакцинирующихся против чумы, туляремии, сибирской язвы людей.

10. Изучить возможность использования предложенных методов для комплексной оценки специфического иммунитета при других инфекциях.

Впервые показано, что защита мышей против заражения К 1и1агеп$1$ 503 (йиЬзр. Но1агсйса) коррелирует с усилением экспрессии С069 рецептора на поверхности Тхелперов, синтезом ИФН-у и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на активацию клеток кислото-нерастворимым комплексом. О наличии протективного иммунитета при заражении штаммом БсИи К 1и1агеп$\$ БиЬэр. 1и1агет1$ — наиболее вирулентным штаммом туляремийного микроба — косвенно свидетельствуют не только уровень антител к липополисахариду и кислото-нерастворимому комплексу Е шШгет’н, способность лимфоцитов синтезировать ИФН-у, ИЛ-17 и активировать Тхелперы под влиянием кислото-нерастворимого комплекса, но также и способность цитотоксических лимфоцитов активироваться под влиянием кислото-нерастворимого комплекса.

Впервые показано, что у вакцинированных против туляремии доноров под влиянием антигенов К Ш1агет15 отмечается специфическое усиление экспрессии маркера ранней активации СБ69 на поверхности Тхелперов и цитотоксических лимфоцитов, и маркера поздней активации НЬД-ЭЯ на поверхности Т-клеток памяти (С03+С04+С045Я0+).

Выявлены разные пути активации Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса у невакцинированных и вакцинированных против туляремии доноров. Под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса лимфоциты вакцинированных доноров активировались через СЭ28 и СШ54 рецепторные молекулы. Лимфоциты неиммунных доноров активировались без участия С0154, что свидетельствовало об отсутствии активации ТЫ иммунного ответа.

Впервые показано, что в отличие от невакцинированных доноров у иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходило усиление экспрессии CD86, что отражает активацию не только гуморального, но и клеточного звена иммунитета.

Выявлены разные механизмы межклеточной активации Т и В лимфоцитов, полученных от интактных и иммунных мышей под влиянием F1 антигена. Активация клеток у иммунных животных происходила по СП28-незаписимому пути за счет взаимодействия рецепторов В лимфоцитов CD40L с индуцибельной мембранной молекулой CD154, способствующей развитию иммунного ответа по Thl пути.

Впервые показано, что маркер поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена У. pestis специфически появляется и на поверхности CD45RO+ Т хелперов и на поверхности CD45RO+ цитотоксических лимфоцитов, полученных от иммунизированных живой чумной вакциной доноров.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты настоящего исследования вносят новые знания о механизмах активации Т и В лимфоцитов иммунного и неиммунного организма под влиянием специфических антигенов Y. pestis и F. tularensis. Научно обосновано и подтверждено в экспериментах на животных, что способность лимфоцитов изменять экспрессию поверхностных маркеров и активность синтеза цитокинов под влиянием антигенов Y. pestis и F. tularensis in vitro отражает наличие специфического клеточного иммунитета, достаточного для защиты от заражения туляремией и чумой. Расширены представления об иммунологических механизмах обеспечения протективного иммунитета против бактерий F. tularensis разной вирулентности.

В результате проведенной работы предложен комплекс иммунологических показателей, отражающих наличие клеточного противотуляремийного и противочумного иммунитета, что важно для оценки иммунобиологических свойств антигенов и штаммов — кандидатов в вакцинные, а также для выявления специфического иммунитета у людей после вакцинации.

Результаты проведенных исследований послужили основой при составлении ниже перечисленных документов:

— «Методические указания. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» (утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12.02.2007 г.) МУ 3.3.1.2161-07;

— «Методические рекомендации. Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29.12.2011 г.) МР 1.2.0052-11;

— «Методические рекомендации. Оценка напряженности специфического клеточного иммунитета у людей к возбудителю туляремии /’п \ч!го» (одобрены Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утверждены директором ФБУН ГНЦ ПМБ, протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 8 от 07.10.2011 г.).

Разработанные документы используются в ФБУН ГНЦ ПМБ, ФКУЗ РНИПЧИ «Микроб» для отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов К /и/аге/мю, изучения свойств потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы против туляремии и чумы, повышения эффективности оценки противочумного и противотуляремийного поствакцинального иммунитета у людей.

Данные экспериментальных исследований диссертационной работы используются при чтении лекций на курсах по магистерской образовательной программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и по программе курсов повышения квалификации «Микробиология. Основы и особенности работы с биологическими агентами 1-1У групп патогенности в научно-исследовательских лабораториях».

Методология и методы исследования

Методология исследования спланирована с учетом современных принципов научного познания и организована адекватно поставленной цели. Объектами исследования являлись экспериментальные животные и доноры, периодически вакцинируемые против чумы, туляремии и сибирской язвы. Предметом исследования являлось изучение особенностей формирования специфических клеточных реакций против возбудителей особо опасных инфекций.

Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов: биологических, микробиологических, микроскопических, иммунологических, цитометрических, оценки физиологического состояния животных, методов статистической обработки результатов.

Биологические методы исследования включали проведение экспериментальных исследований на мышах, термометрирование и определение веса животных, оценку внешнего вида и общего состояния.

Микробиологические методы исследований применяли для выявления обсемененности бактериями органов животных, а также в целях получения бактериальных культур У рея^, К шШгепз’м, В. ашИгасм для иммунизации животных.

Для оценки жизнеспособности иммунокомпетентных клеток, морфологии бактерий, подсчета клеток применяли микроскопические методы исследований.

Цитометрические методы исследований использовали для иммунофенотипирования лимфоцитов, оценки изменения пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием специфических антигенов и митогенов, определения активности синтеза внутриклеточных цитокинов субпопуляциями лимфоцитов, проведения СВА-анализа, позволяющего в небольшом объеме сыворотки или супернатанта выявлять концентрации 10-12 цитокинов одновременно.

Иммунологические методы исследований включали в себя получение спленоцитов, лимфоцитов, культивирование иммунокомпетентных клеток,

определение титра антител к возбудителям туляремии и чумы методом твердофазного иммуноферментного анализа, постановку реакции лейкоцитолиза, реакцию басттрансформации лимфоцитов.

При выполнении работы использовались информационные средства: отечественные и международные научные компьютерные базы данных и информационные ресурсы PubMed, Medline, Wiley Online Library, e-library, материалы российских и зарубежных научных журналов, российских и международных конференций.

Смотрите так же:  Хламидиоз кто вылечился

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена лично автором, а также в сотрудничестве с коллегами: отдела иммунобиохимии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.б.н. С.Ф.Бикетов; отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.м.н. А.Н.Мокриевич; лаборатории биологических испытаний ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.И.Борзилов; лаборатории биологической безопасности ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.Е.Тюрин.

Положения, выносимые на защиту:

1. Усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов, синтеза ИФН-у и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на реактивацию кислото-нерастворимым комплексом, а также наличие антител к липополисахариду и кислото-нерастворимому комплексу F. tularensis коррелируют с наличием протективного противотуляремийного иммунитета у мышей.

2. По изменению количества клеток, экспрессирующих CD69 рецептор на поверхности Тхелперов и HLA-DR маркер на поверхности CD3+CD4+CD45RO+ клеток, под влиянием тулярина можно судить о наличии противотуялермийного клеточного иммунитета у людей.

3. Активация Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса у вакцинированных против туляремии доноров инициируется через CD28 и CD154 рецепторную молекулы. Лимфоциты

неиммунных доноров активируюся без участия CD 154, что свидетельствует о ингибировании Thl иммунного ответа.

4. В крови, полученной от доноров, иммунизированных живой чумной вакциной, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходит усиление экспрессии CD86, что способствует активации Т лимфоцитов.

5. По увеличению экспрессии маркера поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена У. pes lis на поверхности CD45RO+ лимфоцитов можно судить о наличии противочумного клеточного иммунитета у людей.

Степень достоверности и апробация результатов исследования О достоверности результатов работы свидетельствует использование современных автоматизированных и сертифицированных методов исследования, поддерживающихся программными обеспечениями для анализа и статистической обработки результатов. Использование адекватных методов исследования позволило количественно оценить способность Т и В лимфоцитов к специфической активации под влиянием антигенов, а также выявить маркеры отражающие наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 42 от 24 декабря 2014).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск,

2009); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,

2010); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); 10-м интернациональном симпозиуме «Yersinia 2010» (Бразилия, Ресиф, 2010); 6-ой международной конференции по зоонозам (Мексика, Канкун, 2011); 1-ой Международной конференции по инфекционным заболеваниям и

наномедицине (Непал, Катманду, 2012); Международном симпозиуме по опасным заболеваниям (Австрия, Вена, 2014).

Предложенный метод оценки клеточного противтуляремийного иммунитета используется для оценки поствакцинального иммунитета у сотрудников ФБУН ГНЦ ПМБ, а также в учебном процессе Пущинского государственного естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и курсах повышения квалификации при ГНЦ ПМБ.

Основное содержание работы отражено в 35 научных публикациях, в том числе в 13 статьях в журналах из списка изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, одном руководстве и одной монографии.

Объем и cTpyicrypa диссертации

Диссертация изложена на 281 странице, содержит 24 таблицы, 48 рисунков. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Библиография включает в себя 422 источника, в том числе 46 отечественных и 376 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖЕНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 15 А 23 гсс А, F. tularensis Schu, Y. pestis EV линии 15 НИИЭГ, Y. peslis 231, В. artthracis СТИ-1 получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия).

В работе использовали антигены бактерий К Pestis (Fl — капсульный антиген; Pia — плазминоген активатор; V — антиген; УЗД — ультразвуковой дезинтеграт); F. tularensis (KHK — кислото-нерастворимый комплекс, F. tularensis — белково-липополисахаридная фракция; УЗД) и В. anthracis (РА — протективный

антиген и LF — летальный фактор). Препараты КНК предоставлены доктором биологических наук В.М. Павловым (отдел ГНЦ ПМБ). Все препараты антигенов чумного микроба получены из лаборатории микробиологии чумы ГНЦ ПМБ. В работе использовался коммерческий препарат тулярин — аллерген туляремийный жидкий для накожного применения, содержащий бактерии F. tularensis 15, инактивированные нагреванием (ГУП НПО «Микроген»).

Экспериментальная часть выполнена с использованием в качестве биомоделей 2000 инбредных мышей линии BALb/c весом 18-20 г, полученных из отдела экспериментальных животных вивария ГНЦ ПМБ.

В ходе выполнения работы было обследовано 85 вакцинированных волонтеров и 20 не привитых доноров (группа сравнения). Вакцинацию коммерческими живой чумной вакциной (ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора) и живой туляремийной вакциной (ГУП НПО «Микроген») проводили накожным способом в плановом порядке и согласно приказу Минздрава России от 27.07.2001 № 229 «О национальном календаре профилактических прививок по эпидемическим показаниям» и в полном соответствии с утвержденными инструкциями по применению вакцин. Клинические лабораторные исследования проводились согласно лицензии № ФС-99-01-006505 от 17.09.2009, выданной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на осуществление медицинской деятельности ФБУН ГНЦ ПМБ.

Мышей иммунизировали живой туляремийной вакциной однократно, подкожно или внутрикожно в дозах 5, 15, 45 и 135 КОЕ/мышь. На 28 сутки после иммунизации у половины иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и спленоциты на исследования.

Мышей иммунизировали живой туляремийной вакциной однократно, подкожно или внутрикожно в дозе 100 КОЕ/мышь. На 30, 60, 90, 120, 150 и 180 дни после иммунизации у половины иммунизированных мышей отбирали сыворотку крови и спленоциты на исследования.

Мышей иммунизировали подкожно (п.к.) однократно Р. ш1агет1.ч 15Д23гесА (1×103 СРи); двукратно: Р. ш1агет’1Б 15 А 23 гее А (1 * Ю3 КОЕ), а через четыре недели Р. ш1агеги13 15 Д 23 гес А (1хЮ4КОЕ) или Р. Ш1агет1з 15 НИИЭГ (1хЮ4КОЕ). На 28 сутки после последней иммунизации половину мышей из каждой группы использовали для проведения иммунологических исследований.

По 10 экспериментальных животных из каждой группы заражали вирулентным штаммом р. ш1агеп. 1000 34,1±12,3 н/д

Среда + КНК >1000 95±42,3 н/д

Невакцинированные Среда н/д н/д н/д

Среда + тулярин 50±25,21 н/д н/д

Среда + КНК н/д н/д н/д

Примечание: * — в группе вакцинированных доноров п = 25, в группе невакцинированных доноров п = 10; н/д — не детектируется. Жирным шрифтом указаны значения, достоверно отличающиеся от данных группы невакцинированных доноров.

Таким образом, для выявления противотуляремийного клеточного иммунитета у людей предложено оценивать изменение синтеза ИФН-у и ИЛ-17 лимфоцитами и/или усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов и HLA-DR маркера на поверхности CD3+CD4+CD45RO+ клеток в ответ на активацию лимфоцитов КНК.

Оценка клеточного и гуморального иммунитета у мышей линии BALB/c после иммунизации коммерческой живой или экспериментальными чумными вакцинами

Одними из первых клеточных структур, вступающих во взаимодействие с бактерией, являются толл-подобные рецепторы (TLR). Активация TLR способствует инициации иммунного ответа. В частности, усиление экспрессии TLR-2 рецептора способствует презентации антигена и поляризации иммунного ответа по Thl типу [Basto А.Р., 2014; Aliahmadi Е, 2009]. Под влиянием УЗД Y. pestis и V антигена происходило усиление экспрессии TLR-2 на поверхности Т лимфоцитов и моноцитов, а под влиянием F1 — усиление экспрессии TLR-2 на поверхности моноцитов. В присутствии антигенов чумного микроба увеличивалось количество Т лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих TLR-9

рецептор, что было более выражено в группе иммунизированных против чумы мышей, по сравнению с интактными животными.

После взаимодействия Т1Л1 с рецепторами бактерий клетка активируется. Одним из показателей наличия специфического клеточного иммунитета является усиление пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на реактивацию их антигеном. Под влиянием антигена чумного микроба, лимфоциты, выделенные от мышей, иммунизированных У. ревйз ЕУ или препаратом, содержащим И и V антигены У-реэНз, адсорбированные на гидроксиде алюминия, достоверно увеличивали пролиферативную активность ((9,33±1,67) % и (7,73±1,54) %, соответственно) (рисунок 5).

■ Интактные «EV F1/V

Рисунок 5 — Процентное содержание пролиферирующих лимфоцитов, выделенных от интактных и иммунизированных мышей (Y. pestis EV или препаратом, содержащим Fl и V антигены Y. pestis, адсорбированные на

гидроксиде алюминия) Примечание: Условия инкубирования лимфоцитов указаны по оси абсцисс: RPMI — в полной питательной среде, F — в среде в присутствии Fl антигена, V — в среде в присутствии V антигена чумного микроба. По оси ординат — процентное содержание пролиферирующих лимфоцитов.

Анализ пролиферативной активности отдельно Т и В лимфоцитов отразил особенности механизмов формирования противочумного иммунитета после иммунизации живой чумной вакциной и химической на основе Р1 и V антигенов.

Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированные на гидроксиде алюминия, в присутствии F1 увеличивали пролиферативную активность за счет субпопуляции В лимфоцитов. Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, усиливали пролиферативную активность лимфоцитов как за счет В субпопуляции, так и за счет Т субпопуляции.

Таким образом, данные пролиферативной активности лимфоцитов показывают, что после иммунизации живой чумной вакциной активируются и гуморальное и клеточное звено иммунитета, а после иммунизации препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированные на гидроксиде алюминия, формируется, прежде всего, гуморальный иммунный ответ.